概要
バックグラウンド：
COVID-19疾患の肺炎はしばしば微妙な最初の症状を呈し、重症度の評価および最終的な患者の性質の予測のためにバイオマーカーの使用を義務化します。COVID-19肺炎の転帰について硫化水素（H2S）の使用を評価した。
材料と方法：
COVID-19の74人の患者を研究した。臨床データが収集され、生存予測因子が計算されました。血液は入院後24時間以内（1日目）と7日目に収集されました。H2Sは、血清中のモノブロモビマン誘導体（MBB）とその後の高速液体クロマトグラフィーで測定され、プロカルシトニン（PCT）やC反応性タンパク質（ CRP）。腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）とインターロイキン（IL）-6も血清で測定されました。
結果：
生存者は入院後1日目と7日目にH2Sレベルが有意に高かった。150.44μMのカットオフポイントは、80％の感度、73.4％の特異性、95.9％の負の予測値で生存者と非生存者を区別できます。28日後の死亡率は32％で、入院レベルは150.44μΜ以下で、4.1％は150.44μΜ以上です（p：0.0008）。1日目から7日目までのH2Sレベルの低下が36％以上の患者では、死亡率が有意に高かった（p：0.0005）。1日目の血清H2Sは、IL-6およびCRPと負の相関があり、末梢血中の絶対リンパ球数と正の相関がありました。
結論：
H2Sは、SARS-CoV-2コロナウイルスによる肺炎の重症度と最終結果の潜在的なマーカーであると結論付けられています。IL-6との相関は、抗炎症作用を示唆しています。
キーワード：バイオマーカー、硫化水素、インターロイキン-6、死亡率、SARS- CoV-2
前書き
2019年12月以来、人類はCovid-19として知られている病気を引き起こしている新しいSARS-CoV-2コロナウイルス-19による新しいパンデミックを経験しています。 2020年4月17日現在。 2,265,271件の確定症例が世界中で報告され、154,900人が死亡しました（https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019）。死亡の主な理由は、市中感染肺炎の分野で発生する重症呼吸不全（SRF）です。肺内皮の混乱が疾患の病因の特徴であると思われる。これはD-ダイマーおよびこれらの患者における血管内皮増殖因子（の上昇したレベルを示す公開された証拠によって仮定された）。
硫化水素（H 2 S）、専ら環境毒物としての長い思考、今ドライブの血管新生は、血管弛緩を促進することが内皮産物であることが知られているが、アテローム性動脈硬化症を減少させ、防止虚血再灌流障害。最近の動物モデルでは、核因子kBの阻害による抗炎症作用があると考えられているにもかかわらず、SARS-CoV-2が宿主上皮への侵入に使用している受容体であるアンジオテンシン-2との複雑な相互作用が示された。 Hの極めて重要な役割を示唆しているこれらの観察に照らして2 Covid-19の病因においてSを、我々はHの血清レベルを研究2SおよびCovid-19肺炎患者のコホートにおける最終結果との関連。記載された抗炎症特性のため、血清中のH 2 Sのレベルの上昇はCovid-19肺炎の好ましい結果と関連していると仮定します。
患者と方法
この研究は、2020年3月の初めから、ギリシャ敗血症研究グループに参加している8つの部門で実施されました。研究プロトコルは、参加している病院の倫理委員会によって承認されました。書面によるインフォームドコンセントが自分で提供された後、または同意できない患者の場合は第1度の親族が提供した後に、患者が含まれました。胸部X線または肺のコンピューター断層撮影での浸潤の存在によって診断され、SARS-CoV-2の呼吸分泌液の分子検査で入院時に陽性と判定された下気道感染症で入院した患者を登録した。血液は入院の最初の24時間以内に採取され、7日後に繰り返されました。除外基準は、HIV-1感染および好中球減少症で、好中球1,000個/ mm 3未満と定義されました。。SRFは、機械的換気を必要とする200未満の酸素分圧と吸気酸素の割合の比として定義されました。
以下の変数が記録されました。バイタルサイン; 入院時急性生理学および慢性健康評価（APACHE）IIスコア、チャールソン併存症指数（CCI）、逐次臓器不全評価（SOFA）スコア、および肺炎重症度指数（PSI）; 入院時およびフォローアップ時の絶対血球数および生化学; そして28日間の生存。
サンプリング後すぐに、無菌で発熱物質を含まないチューブに血液を採取し、遠心分離のために氷冷して10分未満で輸送しました。 H 2 Sは、それが以前に（説明したように高速液体クロマトグラフィーモノブロモビマン（MBB）導出を使用して、患者の血清中で測定した）。 MBB、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、および5-スルホサリチル酸（SSA）は、Sigma-Aldrich（St. Lewis、MO）から購入しました。硫化ナトリウム（Na 2S）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、およびトリフルオロ酢酸（TFA）はAlfa Aesar（Erlenbachweg、ドイツ）から購入しました。 Tris-HClバッファー（0.1 M pH 9.5）は、AlterChem（ギリシャ、アテネ）から購入しました。誘導体化緩衝液（Tris-HCl 0.1 M pH 9.5、0.1 mM DTPA）の調製のために、DTPAをtris-HClに溶解しました。すべての溶媒とバッファー、および誘導体化反応に使用したチューブは、窒素ガスフロー（それぞれ10秒と30秒）を使用して脱酸素しました。硫化物標準曲線の溶液は、Na 2 Sをリン酸緩衝液に溶解して、4μM〜250μMの最終濃度に調製し、定量限界は10μMでした。 MBB 10 mM誘導体化溶液は、MBBをアセトニトリルに溶解して調製し、暗い容器に等分し、-20℃に保ったo C. SSA 200 mM停止液は、各測定の前に蒸留水にSSAを溶解して新たに調製しました。すべてのサンプル前処理は、薄暗い室内照明の下で行われました。脱酸素後、30μlの血清サンプルまたは標準、70μlのTris-HCl 0.1 M pH 9.5 0.1 mM DTPA、および50μlのMBB 10 mMをチューブに加えました。混合物を低酸素条件（1％O 2）37℃で60分間。誘導体化反応は、50 mMの200 mM SSAを添加して停止し、その後10秒間ボルテックスしました。次に、バイアルを氷上に10分間置き、12,000 rpm、4℃でさらに10分間遠心分離しました。最後に、100μLの上澄みを暗くしたHPLCバイアルに移し、4°Cに保った。分析は、1つのLiChroCART逆相（RP）C18 4.6×250 mm、5μm分析カラムとPurospher RP-18E 4×4 mm、5μMガードを使用して、Agilent 1,100 HPLCシステム（Agilent、Waldbronn、Germany）によって行われました。カラム（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）。グラジエント溶出を使用して、25℃で分析を行いました。移動相は、0.6 ml / minの流速で、アセトニトリル（0.1％TFA、v / v）と水（0.1％TFA）、v / v）で構成されていました。すべての測定は、それぞれ390 nmおよび475 nmの励起波長および発光波長で実行されました。誘導体化生成物の保持時間は12.7分でした。
腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）とインターロイキン（IL）-6の血清濃度を、酵素免疫測定法（R＆D、ミネアポリス、米国）で2回測定しました。検出下限は、TNFαで40 pg / ml、IL-6で10 pg / mlでした。プロカルシトニン（PCT）は、製造元の指示（Kryptor、Brahms、Hennigsdorf、ドイツ）に従って、時間分解増幅クリプテート放出技術アッセイによって測定されました。検出下限は0.06 ng / mLでした。 C反応性タンパク質（CRP）は、比濁分析（Behring、ベルリン、ドイツ）により2重に推定されました。検出下限は0.2 mg / dLでした。
1日目と28日目の生存におけるH 2 Sレベルの関連が、主要な研究エンドポイントでした。1日目から7日目までのH 2 Sレベルの変化と28日の生存率との関連は、試験の副次的評価項目でした。
統計学
カテゴリーデータは頻度として、量的変数は平均±SEとして提示された。グループ間の比較は、カテゴリカルデータのフィッシャー正確検定、定量的データの両側スチューデントt検定またはマンホイットニーU検定を使用して行われました。相関は、スピアマンランクの順位を使用して実行されました。生存率をログランク検定で比較しました。オッズ比と95％信頼区間（CI）は、マンテルとヘンツェルの統計によって計算されました。結果予測のために受信者動作特性（ROC）曲線を分析しました。 Youdenインデックスを使用して、最良のカットオフが選択されました。ハザード比とCIを使用したステップワイズフォワードコックス回帰分析を使用して、28日間の結果に関連する独立変数を調査しました。任意のP 0.05未満の値は統計的に有意であると見なされました。
結果
74人の患者が登録されました。28日間の結果に関連する彼らの人口統計を表に示します。表11そして、補足表1で、http://links.lww.com/SHK/B52。2人の患者がその日の前に死亡した。5人の患者は7日前に退院し、4人の患者は7日目に採血を拒否した。したがって、7日目の測定は63人の患者で行われました。
SARS-CoV-2コロナウイルスによる肺炎患者のベースラインの臨床的および臨床検査の特徴と、好ましくない転帰に関連するパラメーターの段階的Cox回帰分析
1日目と7日目の血清H 2 Sは、28日生存者の間で有意に高かった。1日目と7日目のIL-6とPCTは非生存者の間で高かったのに対し、7日目のCRPは非生存者の間で高かった。H 2 SはIL-6、PCT、およびCRPと負の関連がありました（図（図11）。
SARS-CoV-2コロナウイルスによる肺炎の予後の予測因子としての硫化水素（H 2 S）。
入院後1日目（A）および7日目（B）の患者の血清中のH 2 Sの血清レベル。マンホイットニーU検定による比較。∗∗ P <0.01; ＊＊＊＊P <0.0001。インターロイキン（IL）-6（C、E）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）（G、I）、プロカルシトニン（PCT）（K、M）、およびC反応性タンパク質（CRP）（O、Q）のレベル入院後1日目と7日目の患者の血清中。マンホイットニーU検定による比較。∗∗ P <0.01; ∗∗∗ P <0.001; ＊＊＊＊P <0.0001; nsは重要ではないことを示します。 IL-6（D、F）、TNFα（H、J）、PCT（L、N）、およびCRP（P、R）とH 2の相関入院後1日目と7日目にS。スピアマンの順位相関係数（r s）、補間線、およびP値が提供されます。
非生存者は、より高い絶対好中球数と有意に低いリンパ球を有し、これはすでに報告されているCOVID-19患者の特徴と一致している。血清H 2 Sは絶対好中球数と負の相関がありました。リンパ球の絶対数と正の相関が見られた（図2）。
1日目と7日目の硫化水素（H 2 S）と白血球数の関連。生存者と非生存者間の1日目と7日目の絶対好中球とリンパ球の数を（A、C、E、G）に示します。マンホイットニーU検定による比較を示します。∗ P <0.05; ＊＊＊＊P <0.0001; nsは重要ではないことを示します。 1日目と7日目の絶対好中球とリンパ球の数と血清H 2 Sの相関関係を（B、D、F、H）に示します。スピアマンの順位相関係数（r s）、補間線、およびP値が提供されます。
上記の結果は、生存のマーカーとしての入院H 2 Sのさらなる評価につながった。ROC曲線分析の結果、1日目のH 2 Sの血清レベルが150.44μM未満であることが、死亡の感度と特異性のトレードオフとして最も優れていることがわかりました（図1）。AおよびB）。合計すると、49人の患者の血清中の1日目の血清中のH 2 Sは、50人以上の患者で50人以下でした。28日後の死亡率は、それぞれ32％と4.1％でした（図1）。3C）。死亡のORは11.11でした（95％CI：2.13–5.88、P：0.001）。
SARS-CoV-2コロナウイルスによる肺炎の予後バイオマーカーとしての硫化水素（H 2 S）。
A、SARS-CoV-2による肺炎の28日生存についての1日目の血清H 2 SのROC曲線、AUC曲線下面積、95％信頼区間（CI）、およびP値を示します。 B、28日死亡率の1日目の血清H 2 Sの感度、特異度、陽性予測値（PPV）、および陰性予測値（NPV）。 C、血清H 2 S入院レベルと関連した28日生存のカプラン・マイヤー分析。ログランク検定とP値が与えられます。 D、結果による1日目から7日目までのH 2 Sの倍率変化。点線は36％カットオフを示します。マンホイットニーU検定による比較。＊＊＊＊P <0.0001。 E、血清HのROC曲線28日間の結果の2倍の変化。 F、血清H 2 Sの経時変化に関連する28日間の転帰のカプラン・マイヤー分析。ログランク検定とP値が与えられます。 F、入院後1日から7日までのH 2 S の倍率変化と入院期間の相関関係。 rsは補間線を示します。 ROC、受信機の動作特性。P値が提供されます。
ROC曲線分析により、次のベースライン値が好ましくない結果に関連付けられることが明らかになりました：CCI 3以上、APACHE IIスコア10以上、PSI 113以上、SOFAスコア4以上フォワードフォワードワイズコックス回帰分析は、150.44μMを超える1日目の血清H 2 Sが、重症度スコアが存在する場合でもCOVID-19の好ましくない結果の独立した保護因子であることを示した（表1）。
さらに、血清H 2 Sの経時変化と結果との関連を調査しました。ROC曲線分析は、7日目までにH 2 Sのカットオフが36％減少することを、死亡の最良の識別因子として示しました（図1）。（図3、DおよびE）。これらの患者の生存は延長されました（図3F）。さらに、1日目から7日目までの血清H 2 Sの変化は、入院期間と負の関連がありました（図1）。3G）。
討論
この研究は、主に高い負の予測値のために、SARS-CoV-2による肺炎の結果の予測変数として、ガス伝達物質H 2 Sを示唆しています。
提示された調査結果の1つの解釈は、血清H 2 Sをバイオマーカーとして使用するためのものですが、本質的な値は、体血管系の内皮機能の反映としてのH 2 S に対するものであると感じています。循環の動態から、28日間の生存者はこのガスの消費量が少ないことがわかります。 Hの乱れた生物学的利用能2 Sは、（拡張前炎症性応答の指標として、および内皮機能不全から示唆されている）。これらの両方の状態は、重度のCOVID-19を伴うことがよくあります。
血清H 2 SとIL-6の間の負の関連は興味深いものです。 IL-6は、COVID-19による重度の肺損傷、呼吸不全、および死亡につながるサイトカインストームに関与する主な炎症誘発性サイトカインとして提案されています。これは、ＩＬ－６産生の調節の治療戦略の評価にさえ導いた。 IL-6Rの遮断薬であるトシリズマブは、IL-6シグナル伝達経路を効果的に遮断することができ、現在、世界中のCOVID-19患者を対象としたいくつかの臨床試験で評価されています。私たちの結果は、H 2 SがIL-6の内因性ダウンレギュレーターであり、その消費が好ましくない結果へのドライバーであると仮定しています。また、外因性H 2の考慮事項につながる可能性があります治療戦略としてのS補充。確かに、H 2 Sを吸入すると、炎症性サイトカイン、特にIL-6が減少し、実験的内毒素血症後のマウスの生存率が増加することが示されている。
さらに、血清H 2 Sはリンパ球数と正の相関がありました。リンパ球減少症はCOVID-19患者の主要な特徴であり、死亡率の予測因子と見なされている。内因性H 2 Sとリンパ球数の間の負の関連は、T細胞活性化因子としてのH 2 Sの役割を支持するin vitroデータと一致している可能性があります。
COVID-19患者を評価するためのH 2 S の重要な役割は、連続測定にさらに依存しています。この研究は、7日後に高いレベルを維持するすべての患者に、好ましくない結果のリスクがなかったことを示しています。この発見は、血清H 2 Sの連続測定が、意思決定のために、CRPやPCTなどの他の確立されたバイオマーカーとともに、補助的基準として利用できることを示唆している可能性があります。ただし、これらは小さなコホートからのデータであり、患者のより大きなコホートでの検証を義務付けています。
脚注
Georgios Renieris、Konstantina Katrini、およびChristina Damoulariの作者は同等に貢献しました
資金源：G. Renierisは、MarieSkłodowska-Curie助成金契約European Sepsis Academy（契約番号676129）に基づいて、欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから資金を得ています。
研究は、ギリシャの敗血症研究グループによって資金提供されています。
競合する利害関係者：EJ Giamarellos-Bourboulisは、AbbVie USA、Abbott CH、InflaRx GmbH、MSDギリシャ、XBiotech Inc.、Angelini Italyから名誉を受け取りました。 AbbVie、Abbott、Astellas Pharma Europe、AxisShield、bioMérieuxInc、InflaRx GmbH、およびXBiotech Inc.からの独立した教育助成金。 FrameWork 7プログラムHemoSpec（アテネ国立およびカポディストリアン大学に付与）、Horizon2020マリーキュリープロジェクトヨーロピアンセプシスアカデミー（アテネ国立およびカポディストリアン大学に付与）、およびHorizon 2020欧州グラントImmunoSep（付与ギリシャの敗血症研究所へ）。
この記事では補足のデジタルコンテンツを利用できます。直接URLの引用は印刷されたテキストに表示され、ジャーナルのWebサイト（www.shockjournal.com）のこの記事のHTMLおよびPDFバージョンで提供されます。
参考文献
1. Zhu N、Zhang D、Wang W、Li X、Yang B、Song J、Zhao X、Huang B、Shi W、Lu Rなど 中国の肺炎患者からの新しいコロナウイルス、2019年。N Engl J Med 382 （8）：727–733、2020。[ PMC free article ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
2. Zhou F、Yu T、Du R、Fan G、Liu Y、Liu Z、Xiang J、Wang Y、Song B、Gu Xなど。 中国武漢でのCOVID-19の成人入院患者の死亡率の臨床経過と危険因子：後ろ向きコホート研究。Lancet 95 （10229）：1054–1062、2020。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
3. Zhang W、Zhao Y、Zhang F、Wang Q、Li T、Liu Z、Wang J、Qin Y、Zhang X、Yan Xなど 中国からの臨床免疫学者の視点：深刻なコロナウイルス病2019（COVID-19）を持つ人々の治療における抗炎症薬の使用。Clin Immunol 214：108393、2020。[ PMC無料の記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
4. Szabo C、Papapetropoulos A. 基本および臨床薬理学の国際連合。CII：H2Sレベルの薬理学的変調：H2SドナーとH2S生合成阻害剤。Pharmacol Rev 69 （4）：497–564、2017。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
5. マーフィーB、Bhattacharya R、Mukherjee P. ミトコンドリアおよび疾患における硫化水素シグナル伝達。FASEB J 33 （12）：13098–13125、2019. [ PMC free article ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
6. ベネデッティF、ダビネリS、クリシュナンS、ガロRC、スカパニーニG、ゼラD、カレリS。硫黄化合物は、マイコプラズマファーメン タンスに感染したマクロファージによるNF-κB阻害によるMCP-1産生をブロックします。J Transl Med 12 （1）：145、2014。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
7. Lin Y、Zeng H、Gao L、Gu T、Wang C、ZhangH。 硫化水素は、アンギオテンシン変換酵素2の発現を調節することにより、部分的に結紮された頸動脈マウスモデルのアテローム性動脈硬化を軽減します。Front Physiol 8：782、2017。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
8. 花王KC、Hsieh MJ、Lin SW、Chuang LP、Chang CH、Hu HC、Wang CH、Li LF、Huang CC、Wu HP。 急性呼吸窮迫症候群の高齢患者における生存予測因子：前向き観察コホート研究。Sci Rep 8 （1）：13459、2018. [ PMC free article ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
9. Kim MA、Park JS、Lee CW、Choi WI。 ウイルスコミュニティの肺炎重症度指数は成人の肺炎を獲得した。PLoS One 14 （3）：e0210102、2019. [ PMC free article ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
10. 小池S、川村K、木村Y、渋谷N、木村H、小笠原Y。 蛍光およびタンデム質量分析検出を備えた高速液体クロマトグラフィーによるマウス脳内の内因性H2SおよびH2Snの分析。Free Radic Biol Med 113 （12）：355–362、2017。[ PubMed ] [ Google Scholar ]
11. Shen X、Pattillo CB、Pardue S、Bir SC、Wang R、Kevil CG。 in vivoおよびin vitroでの血漿中の硫化水素の測定。Free Radic Biol Med 50 （9）：1021-1031、2011。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
12. Wang D、Hu B、Hu C、Zhu F、Liu X、Zhang J、Wang B、Xiang H、Cheng Z、Xiong Yなど 武漢、中国の2019新しいコロナウイルスに感染し、肺炎で138人の入院患者の臨床的特徴。JAMA 2020; [印刷前のEpub]。[ PMCの無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
13. Wang R、Szabo C、一ノ瀬F、Ahmed A、Whiteman M、Papapetropoulos A. 内皮機能障害におけるH2Sバイオアベイラビリティの役割。Trends Pharmacol Sci 36 （9）：568–578、2015。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
14. Flammer AJ、Anderson T、Celermajer DS、Creager MA、Deanfield J、Ganz P、Hamburg NM、LüscherTF、Schechter M、Taddei Sなど 内皮機能の評価：研究から臨床診療まで。Circulation 126 （6）：753–767、2012。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
15. Ruan Q、Yang K、Wang W、Jiang L、 SongJ。中国、武漢の150人の患者のデータ分析に基づく、COVID-19による死亡率の臨床予測因子。Intensive Care Med 2020; [印刷前のEpub]。[ PMCの無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
16. Zhang C、Wu Z、Li JW、Zhao H、Wang GQ。 重症のCOVID-19のサイトカイン放出症候群（CRS）とインターロイキン-6受容体（IL-6R）拮抗薬のトシリズマブは、死亡率を低下させる鍵となる可能性があります。Int J Antimicrobエージェント 2020; 105954. [ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
17. 徳田K、木田K、丸谷E、クリミE、ブガキM、カトリA、木村H、一ノ瀬F。 硫化水素を吸入すると、エンドトキシンによる全身性炎症が防止され、マウスの硫化物代謝が変化することで生存率が向上します。Antioxid Redox Signal 17 （1）：11–21、2012。[ PMC無料記事 ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
18. Miller TW、Wang EA、Gould S、Stein EV、Kaur S、Lim L、Amarnath S、Fowler DH、Roberts DD。 硫化水素は、T細胞活性化の内因性増強剤です。J Biol Chem 287 （6）：4211–4221、2012. [ PMC free article ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
